É o primeiro local de atuação do herbicida. Geralmente inibem a atividade de uma enzima e/ou proteína específica na célula da planta, desencadeando uma série de eventos metabólicos que ocasionarão alterações no crescimento e no desenvolvimento, podendo levá-la à morte.
Cada mecanismo de ação é constituído por herbicidas do mesmo grupo químico ou de grupos químicos distintos. Herbicidas com o mesmo mecanismo de ação possuem atividades similares e produzem sintomas de injúria semelhantes.
Atualmente, no Brasil existem classificados 16 mecanismos de ação. Inibidores da ACCase (Acetil CoA carboxilase); Inibidores da ALS (Acetolactato sintase); Inibidores da fotossíntese no fotossistema II - Acopladores da D1 serina 264; Inibidores da fotossíntese no fotossistema II - Acopladores da D1 histidina 215; Inibidores da fotossíntese no fotossistema I (PSI) - Desvio de elétrons; Inibidores da Protoporfirinogênio oxidase (PPO/ PROTOX); Inibidores da HPPD (Hidroxifenil Piruvato Dioxigenase); Inibidores da Deoxi-D-Xilulose Fosfato (DOXP) Sintase; Inibidores da EPSP sintase (Enol Piruvil Shiquimato Fosfato Sintase); Inibidores da Glutamina Sintetase; Inibidores da síntese de DHP (dihidropteroato); Inibidores da formação de microtúbulos; Inibidores da síntese de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFAs); Inibidores da síntese de celulose; Mimetizadores de auxina; Desconhecido.
Para mais informações sobre a classificação dos herbicidas de acordo com o mecanismo de ação e grupo químico, acesse a página "MECANISMOS DE AÇÃO".